婴儿型多囊肾家系PKHD1基因的突变分析

郭小艳;王志红;廖娟;周春燕;王鸿;耿丹明;兰风华

【摘 要】目的 对1个婴儿型多囊肾家系的致病基因PKHDI进行突变分析. 方法 先证者母亲怀孕两次,胎儿均在围产期死亡,且两次胎儿彩超结果相似,符合多囊肾改变.提取先证者父母及其他成员外周血基因组DNA,PCR扩增PKHD1基因编码区并进行序列测定；找到突变后,对相应PCR产物进行酶切鉴定或变性高效液相色谱分析,以证实突变. 结果 先证者家系成员序列分析表明,其父和祖母PKHD1基因第59外显子存在杂合突变(c.9901G＞T),其母和外祖母PKHD1基因第53外显子存在杂合的缺失突变( c.8317delG).两个突变均导致mRNA提前出现终止密码子. 结论 发现两个新的PKHD1基因突变；若胎儿同时遗传了这两个突变,将导致婴儿型多囊肾的发生.

【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》

【年(卷),期】2012(004)004

【总页数】6页(P227-232)

【关键词】婴儿型多囊肾;PKHD1基因;基因突变;突变分析

【作 者】郭小艳;王志红;廖娟;周春燕;王鸿;耿丹明;兰风华

【作者单位】福建医科大学福总临床医学院(南京军区福州总医院)临床遗传与实验医学科,福建,福州350025;福建医科大学福总临床医学院(南京军区福州总医院)临床遗传与实验医学科,福建,福州350025;福建医科大学福总临床医学院(南京军区福州总医院)临床遗传与实验医学科,福建,福州350025;福建医科大学福总临床医学院(南京军区福州总医院)临床遗传与实验医学科,福建,福州350025;南京军区福州总医院超声诊断科,福建,福州350025;南京军区福州总医院超声诊断科,福建,福州350025;福建医科大学福总临床医学院(南京军区福州总医院)临床遗传与实验医学科,福建,福州350025

【正文语种】中 文

常染色体隐性多囊性肾病（autosomal recessive polycystic kidney disease，ARPKD）是一种严重的遗传性肾肝疾病，典型者在婴儿期发病，因此，ARPKD通常又被称为婴儿型多囊肾病。其发病率为1∶20000，人群携带者为1:70[1]。30%～50%的患病胎儿因羊水过少导致肺发育不全而在围产期死亡，此期主要为肾损害。影像学检查主要表现为双肾收集管的非梗阻性梭形膨大，回声增强，呈陶土样“Potter”羊水过少症。如果渡过新生儿期，则大约一半的患儿会进展至终末期肾病[2,3]。部分患者在儿童期或成年后才发病，主要表现为肝损害（肝小叶间导管的增生和扩张）和肝门纤维化（卡利综合症）等[4]。ARPKD的致病基因为多囊肾和肝脏疾病1（polycystic kidney and hepatic disease 1，PKHD1）。目前报道的基因突变数达702个（http:// www.humgen.rwth-aachen.de）。我科接诊了一个ARPKD家系，经基因序列分析发现了2个PKHD1基因新突变，这不仅充实了突变数据库，也为该家系开展产前分子诊断奠定基础。

1.1 病例资料

先证者母亲（Ⅱ2、图1）徐某，福州闽侯县人，31岁。2006年第一胎（Ⅲ3）孕20周时因胎动异常于福建省妇幼保健院行彩超检查，发现胎儿肾脏发育异常，即于孕24周行引产术。2007年第二胎（Ⅲ4）孕20周在我院行产检，胎儿彩超检查结果与前次相似，呈双肾肿大及弥漫性囊性改变，并于孕28周早产，生下一死胎。临床诊断为婴儿型多囊肾。先证者父母均无多囊肾临床症状和体征，祖父生前30岁左右开始出现肾功能异常，肾功能检查提示有蛋白尿（++），后发展至尿毒症死亡，其他家庭成员无类似情况（图1）。

1.2 先证者父母PKHD1基因突变分析

因先证者未留下任何标本，故从其父母及其他成员入手。应用碘化钾法提取先证者父母全血基因组DNA，参考相关文献PCR引物和扩增条件[5,6]，分别扩增先证者父母全血基因组DNA PKHD1基因（NG_008753）最长开放阅读框编码区的66个外显子。PCR总反应体积为25μL：4种dNTP各0.2 mmol/L、10×buffer 2.5 μ L、上下游引物各10 pmol、DNA模板100 ng、TaqDNA聚合酶2.5 U。在PCR扩增仪（ABI，2720 Thermal Cycler，美国）上完成扩增反应，条件如下：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s， 72℃延伸45 s，共30个循环；最后一个循环在72℃下延伸10 min。PCR产物经纯化后送上海生工测序。

1.3 先证者父亲第18、59外显子PCR产物酶切鉴定及多态性筛查

经Omiga软件分析，先证者父亲外显子18的杂合错义突变（c.1675C＞T）导致Mspl酶切位点（CCGG）消失，正常人存在该酶切位点；外显子59的杂合突变

（c.9901G＞T）导致出现新的Mph1103l酶切位点（ATGCAT），而正常人无该酶切位点。故分别用性内切酶Mspl、Mph1103l（Fermentas，加拿大）进行酶切鉴定。酶切体系参照性内切酶说明书：PCR产物10 μ L，酶1.5 μ L，酶切体系总体积30 μL；37℃酶切2 h后用3%的琼脂糖凝胶电泳观察结果。同时对100份正常人外显子18、59的杂合突变进行酶切鉴定。

1.4 先证者母亲第53外显子PCR产物DHPLC的鉴定

先证者母亲外显子53杂合缺失经Omiga软件分析后，无酶切位点改变，故用美国Transgenomic公司WAVE核苷酸片段分析系统（MD-4000）DHPLC进行鉴定。设流速为0.9 mL/min，A液41%，B液59%，变性温度为58℃。PCR产物直接上机检测，以经测序无任何碱基改变的正常人外显子53片段的PCR产物作为对照。

1.5 家系调查

根据先证者父母表型和已发现的突变，分别针对先证者祖母、伯父的PKHD1基因外显子18、59片段和外祖父母PKHD1基因的外显子53片段进行序列分析，相关PCR反应和条件如前。PCR产物纯化后送上海生工测序。

2.1 临床诊断及超声检查所见

先证者母亲两次怀孕，胎儿均在围产期死亡。第二胎超声检查示：中孕，羊水极少，胎儿心内结构未见明显异常，胎儿-胎盘循环功能正常，双肾肿大及弥漫性病变（婴儿型多囊肾）（图2）。且第一胎彩超结果与第二胎相似。结合两次异常胎产史和影像学资料，

婴儿型多囊肾的临床诊断基本成立。

2.2 先证者父母PKHD1基因序列分析

对先证者父母PKHD1基因66个外显子的PCR产物进行序列测定。结果表明：在其父外显子18中有一杂合的错义突变：c.1675C＞T（图3①），该突变导致第559位的精氨酸变为色氨酸；外显子59有一杂合突变：c.9901G＞T（图3③），该突变使其编码的第3301位的谷氨酸变为终止密码子。而其母外显子53出现杂合缺失突变：c.8317delG（图3⑤），该突变使其后的第13个密码子变为终止密码子。在其父外显子4、36、58以及其父母外显子22中发现如下碱基改变：c.234C＞T、c.56C＞T、c.9492C＞T、c.2278C＞T以及9个内含子区碱基改变（c.527+51G＞T、c.527+19T＞C、 c.602+67G＞A、c.2407+50C＞T、c.3629-32A＞G、c.7734-4T＞C、c.8302+12T＞A、c.8798-19A＞C、c.8798-31delT）和11个SNP。查阅数据库（http:// www.humgen.rwth-aachen.de），可知c.1675C＞T已有报道，可能为致病突变；而c.9901G＞T、c.8317delG未曾见有相关报道，为国际首报；其余碱基改变均为非致病性改变。

2.3 先证者父母基因突变的验证

2.3.1 酶切证实 PKHD1基因外显子18片段大小为237 bp，正常人应用Mspl酶切后会产生136 bp和101 bp两条片段；外显子59片段大小为301 bp，患者父亲相应片段PCR产物经Mph1103l酶切后产生135 bp和166 bp两条片段。因二者皆为杂合突变，故患者父亲等位基因的一半被酶切，另一半则与正常人相同（图4A、4B）。

2.3.2 DHPLC证实 先证者母亲外显子53片段经DHPLC分析提前出现洗脱峰，且有多个不同峰型出现。正常对照只有一个正常的洗脱峰（图4C）。

2.4 家系调查及多态性分析

先证者祖母（Ⅰ3）的PKHD1基因中同时检测到先证者父亲（Ⅱ3）存在的c.1675C＞T和c.9901G＞T突变（图3②④），这说明两个突变位于同一等位基因，由此可知先证者祖父（Ⅰ4）至少一个PKHD1等位基因是正常的；先证者外祖母（Ⅰ1）检测到与其母亲（Ⅱ2）相同的PKHD1突变（图3⑥）。同时我们发现在100份正常人样品中，有2个正常人外显子18片段出现类似先证者父亲（Ⅱ3）的酶切改变，且结果经测序证实；未见正常人有外显子59的c.9901G＞T突变，这说明c.1675C＞T为多态性碱基改变，而c.9901G＞T为致病性突变。

多囊肾病（polycystic kidney diseases，PKD）是一种进展性的遗传性肾病，主要表现为双肾多囊肿形成和终末期肾病（end-stage renal disease，ESRD）。在遗传上，多囊肾主要有显性和隐性两种形式：常染色体显性多囊肾病（autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD）和ARPKD。其中ADPKD占PKD的95%～98%，ARPKD占PKD的2%～5%（GeneReview）。通常ADPKD在成年后出现肝肾相关症状。与ADPKD相比，ARPKD临床症状更为严重，可导致新生儿死亡、儿童慢性肾病、成人肝脏疾病[7]。ARPKD常见临床表现为呼吸衰竭、高血压和泌尿道感染，且通常在新生儿期或幼年时期已十分典型[5]。部分患者迟至儿童期甚至成年后才有典型多囊肾症状，在临床上与ADPKD难以区分[8,9]。目前，ARPKD的诊断依赖于临床发现，尤其是相关脏器的影像学异常改变（囊性改变，如前影像资料所述）或者是典型病理活组织检查。针对

致病基因PKHD1的分子诊断则可进一步研究其发病的分子机制以及开展产前诊断[10]。

ARPKD致病基因PKHD1位于6p12，是迄今所知的最大人类基因之一，它长约470 kb，编码由一系列9～16 kb大小不等的剪接变异体。最长开放阅读框由66个外显子组成，编码由4074个氨基酸残基组成的蛋白质（FPC），分子量为447 kD[5]。目前，突变数据库中已有报道的突变数已达702个，突变检出率最高达87%[5]。突变类型主要有错义突变、截短突变（包括移码突变、无义突变和剪接位点改变）[11]。至今报道的近60%的基因突变是截短突变，40%则是错义突变[12]。大多数PKHD1基因突变具有家族特异性，无突变热点，且多数都是复合杂合突变。所有带两个截短突变的患者都表现为重型ARPKD（致死型），即导致产前或新生儿期死亡；渡过新生儿期的患者必然带有一个错义突变[2,12～19]。不少研究表明，具有相同突变组合的患者的表型有差异，推测这是由于修饰基因和环境因素的影响[18]。

我科接诊的婴儿型多囊肾家系的先证者母亲怀孕两次，胎儿均在围产期死亡，且彩超结果均符合多囊肾表现。通过对先证者父母基因序列进行分析，我们在其母PKHD1基因亲外显子53发现截短突变c.8317delG，在其父亲PKHD1基因外显子59也发现截短突变c.9901G＞T。考虑到ARPKD的常染色体隐性遗传模式，我们推测两胎儿均同时遗传其父母的两个截短突变，使得胎儿的基因型复合了两个截短突变，最终导致婴儿型多囊肾的发生。因其祖父30岁左右也有肾脏异常，最后因尿毒症死亡，一个很自然的问题是：他是否患有迟发型ARPKD？本研究表明，患者父亲的突变型PKHD1等位基因来自其祖母；相应地，其正常的PKHD1基因则来自其祖父，即其祖父最起码有一个PKHD1等位基因是正常的，因此可完全排除其患ARPKD的可能性。

PKHD1基因由86个外显子组成，形成大量拥有不同外显子组合的转录本。其中最长的转录本有67个外显子（图5B），编码 fi brocystin/polyductin蛋白（FPC）（外显子1不参与编码蛋白）[13]。FPC定位于肾上皮细胞初级纤毛，尤以基底部水平最高[20]。基本结构如图5A所示：C端为跨膜区，有一短的由192个氨基酸组成的短肽位于细胞内，内有cAMP/cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点，该位点具有重要作用；N端则有一庞大的氨基酸链胞外部分，包括免疫球蛋白样丛蛋白转录因子结构域（immunoglobulin like plexin-transcription-factor domain，IPT domain），而末端则为一平行β螺旋1重复区（multiple parallel ß-helix 1 repeats，PbH1）[13,17]。先证者父亲外显子59和先证者母亲外显子53的突变均将导致该蛋白质C端跨膜区和胞浆区缺失，为截短蛋白，使FPC蛋白无法固定在相应细胞膜上，丧失其在正常情况下所具的生理功能（图5C/D）。至于这两个截短突变导致婴儿型多囊肾的具体分子机制，还有待进一步实验探究。

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