化学发光酶免疫分析法测定血清前列腺特异性抗原的研究

第９卷第２期　２００８年４月　’　北华大学学报（自然科学版）　Ｖｏ１．９　Ｎｏ．２　Ａｐｔ．２００８　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＥＩＨＵＡ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）　文章编号：１００９．４８２２（２００８）０２－０１２５－０３　化学发光酶免疫分析法测定　血清前列腺特异性抗原的研究　李旭姓　，韩松涛　，杨春玫　（１．北华大学基础医学院，吉林吉林摘要：目的果１３２０１３；２．吉林市第二人民医院，吉林吉林１３２０１２）　建立化学发光酶免疫分析法测定血清前列腺特异性抗原，用于临床前列腺癌、前列腺增生、前列腺　化学发光酶免疫分析法（ＣＬＥＩＡ）采用辣根过氧化酶（ＨＲＰ）－鲁米诺竞争法．结　Ｌ的范围内线性良好．ＣＬＥＩＡ测定血清前列腺特异性抗原的批　炎患者病情的监测和预后．方法该方法的灵敏度为０．０１雌／Ｌ，在０．５～８０　内、批间与日间变异系数分别为５．０％，４．９７％和４．９３％　在血红蛋白浓度＜２．４　ｇ／Ｌ、总胆红索浓度　＜３４２　ｔｔｍｏｌ／Ｌ、甘油三酯浓度＜９．９　ｍｍｏｌ／Ｌ时的干扰率无临床意义．与放射免疫分析法有较好的相关性（ｒ＝　０．９４７　２）．结论ＣＬＥＩＡ法测定血清前列腺特异性抗原能及时有效地满足前列腺癌、前列腺增生、前列腺炎患者　的临床需要，有助于进一步对检测试剂盒的研制．　关键词：前列腺特异性抗原；化学发光酶免疫测定法（ＣＬＥＩＡ）；前列腺癌；前列腺增生　中图分类号：Ｒ４４６．１１　文献标识码：Ａ　Ｏｎ　Ｓｅｒｕｍ　Ｐｒｏｓｔａｔｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　Ｃｈｅｍｉｌｍｉｕｎｅｓｃｅｎｃｅ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｕ　Ｘｕ—ｓｈｅｎ　，ＨＡＮ　Ｓｏｎｇ—ｔａｏ　，ＹＡＮＧ　Ｃｈｕｎ—ｍｅｉ　（１．Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆＢｅｉｈｕａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｌｉｎ　１３２０１３，Ｃｈｉｎａ；２．Ｔｈｅ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｉｎ　Ｊｉｌｉｎ嘶，Ｊｉｌｉｎ　１３２０１２，Ｃｈｉａ）ｎ　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ｔｈｅ　ＣＬＥＩＡ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｅｒｕｍ　ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ａｎｔｉｇｅｎ，ｐｒｏｓｔａｔｉｃ　ｃａｎｃｅｒ，ｐｒｏｓｔａｔｉｃ　ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ　ａｎｄ　ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．Ｍｅｔｈｑｘｌｓ　ＣＬＥＩＡ　ＨＲＰ－－Ｉｓｏｌｕｍｉｎｏｌ　ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｗａｓ　０．０１　ｇ／Ｌ，ｔｈｅ　ａｓｓａｙ　ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ　ａ　ｇｏｏｄ　ｌｉｎｅａｒ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈｉｎ　ｈｔｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　０．５—８０　ｇ／Ｌ，ｗｉｔｈｉｎ—ｍＲ　ａｎｄ　ｂｅｔｗｅｅｎ－ｄａｙ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ　ｏｆ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　５．０％，４．９７％ａｎｄ　４．９３％　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　Ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ　Ｈｂ＜２　４　ｇ／Ｌ，ＴＢｉｌ＜３４２　ｉ￣ｍｏｌ／Ｌ，ＴＧ＜９．９　ｍｍｏｌ／Ｌ　ｈａｄ　ｎｏ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｃｅ．Ｔｈｅ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｄｅｇｒｅｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ａｓｓａｙ　ａｎｄ　ＲＩＡ　ｗａｓ　ｈｉ：ｇｈｌｙ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ（ｒ＝０．９４７　２）．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＣＬＥＩＡ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｅｒｕｍ　ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｃａｎ　ｓａｔｉｓｆｙ　ｔｈｅ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｐｒｏｓｔａｔｉｃ　ｃａｎｎｅｒ，ｐｒｏｓｔａｔｉｃ　ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｃｈ　ｗｉｌｌ　ｂｅ　ｈｅｌｐｆｕｌ　ｔｏ　ｄｅｖｅｌｏｐ　ａｎ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ；Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ　ｃａｎｃｅｒ；Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ　ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ　前列腺特异性抗原（Ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ａｎｔｉｇｅｎ，　凝固蛋白Ｉ和Ⅱ，使精液液化　在精液中ＰＳＡ含量　ＰＳＡ）是一种由ｈＫＬＫ３基因编码并由前列腺上皮细　较高，在正常男性血　青中仅可检测到微量的ＰＳＡ　胞分泌的单链糖蛋白，具有糜蛋白酶活性　在正常　（０—４　ｇ／Ｌ），在精液中的浓度大约是血清中浓度　情况下，ＰＳＡ主要被分泌到前列腺液中，水解精液　（０　５—５　５　ｇ／Ｌ）的１００万倍．前列腺腺泡内容物　收稿日期：２００７—１０－０５　作者简介：李旭牲（１９６６一），女，副教授，主要从事生物化学技术在疾病诊断中的应用研究　维普资讯 http://www.cqvip.com

１２６　北华大学学报（自然科学版）　第９卷　（富含ＰＳＡ）与淋巴系统之间存在由内皮层、基底细　１．２发光原理　胞层和基底膜构成的屏障相隔，当肿瘤或其他病变　鲁米诺（氨基苯二酰肼）在碱性条件下是以单　破坏这道屏障时，腺泡内容物即可漏人淋巴系统，　阴离子的形式存在，当加入Ｈ　０　后，由于Ｈ　０　与　并随之进入血液循环，导致外周血ＰＳＡ水平升高．　此形式的鲁米诺不起明显作用，需借助于催化剂一　ＰＳＡ在血清中主要有两种存在形式：一种是游离型　协同氧化剂（ＨＲＰ）使鲁米诺转换成具有更大活性　的ＰＳＡ（Ｆ—ＰＳＡ），约占血清ＰＳＡ总浓度的１Ｏ％～　的基型，借助于ＨＲＰ中的Ｆｅ¨，Ｈ　Ｏ　及其中间过　３０％；另一种是与Ｏｔ　一抗糜蛋白酶（ＡＣＴ）结合的　氧化氢阴离子即与鲁米诺反应形成一不稳定的中　ＰＳＡ（ＰＳＡ—ＡＣＴ），约占血清ＰＳＡ总浓度的７０％～　间体，它是一种内过氧化物，此内过氧化物迅速衰　９０％．对于健康男性，释放人血中的ＰＳＡ浓度很低，　变成一电子激发态的氨基酞酸盐阴离子，继而在松　＜４　ｇ／Ｌ．但是，在前列腺癌患者血清中，ＰＳＡ会同　弛至基态过程的同时发出光束　Ｊ．其最大光强度产　现另外的组合形式，比如ＰＳＡ与蛋白Ｃ抑制剂的组　合等．ＰＳＡ作为前列腺癌的特异性标志物，对前列　腺癌的诊断特异性达９０％～９７％，被认为是最有价　值的前列癌的肿瘤标志物，被广泛应用于前列腺癌　的筛选、诊断及治疗后的监测．　测定血清前列腺特异性抗原的常用方法为放　射免疫测定法（ＲＩＡ）．该方法结合了放射性同位素　的敏感性和免疫反应的特异性，是一个可靠、经济　和特异的测定方法．　化学发光酶免疫测定法（ＣＬＥＩＡ）是继酶免疫　测定（ＥＩＡ）、放射免疫测定（ＲＩＡ）之后发展起来的　一种新型免疫标记测定技术．它集灵敏的化学发光　分析和特异的免疫测定于一体，以其快速、敏感、特　异等特性可与酶免疫测定和放射免疫测定相媲美，　又以其试剂无毒、安全稳定、价廉易得而优于后两　者，是一种很有发展前途的生物学检测技术…．该　技术将酶免疫的单克隆抗体的特异性和化学发光　的敏感性以及酶促反应交融于一体，可用于体内微　量物质的测定，我们所选用的化学发光酶免疫测定　法（ＣＬＥＩＡ），是用辣根过氧化酶（ＨＲＰ）标记抗原或　抗体，在免疫反应的终点，在以鲁米诺一Ｈ　０　发光系　统或三辛烷基磷化氢氧化物（ＴＯＰＯ）等发光体系测　定发光的强度，检测生物活性物质的含量．检测时　间一般要比放射免疫测定和酶免疫测定快，其反应　过程如下所示（竞争法）：　酶一Ａｇ＋Ａｂ＋Ａｇ——＋Ａｇ—Ａｂ＋酶一Ａｇ—Ａｂ，　酶．Ａｇ．Ａｂ＋发光协同反应物—一光．　１材料与方法　１．１实验原理　ＣＬＥＩＡ抗原竞争法采用聚苯乙烯管为载体（聚　苯乙烯管经过戊二醛处理及　射线照射以改善与　抗体的结合功能　剖），外包被ＰＳＡ抗体（Ａｂ），与样　本及辣根过氧化酶（ＨＲＰ）标记的ＰＳＡ（ＨＲＰ—Ａｇ）混　合，温育后加人发光底物液，检测发光数值．　生于４２５　ｎｌｎ处．　１．３仪器与试剂　ＳＨＧ．Ｃ生物化学发光测量仪（上海市检测技术　所上立检测仪器厂）．试剂：根据实验原理自行配制　（ｐＨ　７．２ＰＢＳ，１％ＢＳＡ，ｐＨ　９．６ＣＢＳ），ＨＲＰ为市售化　学试剂，前列腺特异性抗原及前列腺特异性抗原抗　体（中国原子能研究所），辣根过氧化酶（ＨＲＰ）标　记的前列腺特异性抗原（ＨＲＰ—Ａｇ）为北华大学基础　医学院生物化学实验室标记，方法为改良过碘酸钠　标记法．酶标记抗原的质量鉴定采用双向免疫扩散　法，标记率大　．３（Ａ４０３／Ａ　８０＝０．３２３）．　１．４测定方法　取２Ｏ　Ｌ血清加入已包被前列腺特异性抗原抗　体的聚苯乙烯试管中，再加入１００　ＩｘＬ　ＨＲＰ一前列腺　特异性抗原，置３７℃下２　ｈ，ＰＢＳ缓冲液冲洗３次，　每次３　ｒａｉｎ，加入０．１　ｍ０ｌ／，Ｌ　ＮａＯＨ　１００　ＩｘＬ，　３０　ｍ０ｌ／，Ｌ鲁米诺１００　ＩｘＬ，室温静置１０　ｍｉｎ后，加入　３％Ｈ　Ｏ　１００　ＩｘＬ立即测定发光强度（每６　ｓ测定１　次），从发光仪上读取数值，见表１．　表１化学发光强度与前列腺特异性抗原浓度　Ｔａｂ．１　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｓｐｅｃｍｃ　ａｎｔｉｇｅｎ　１．５统计学方法　用ＳＰＳＳ统计软件进行均数（　）、标准差（ｓ）、变　异系数（ＣＶ）的分析，采用直线回归分析和配对ｔ　检验．　２　结　果　从表１可以看出，用本试验建立的测定方法检　测样品，随着样品中ＰＳＡ浓度的增高，发光强度逐　渐减弱，呈现典型竞争关系．　２．１分析灵敏度　以不含ＰＳＡ的样品稀释液为测定样品重复测　维普资讯 http://www.cqvip.com

第２期　李旭牲，等：化学发光酶免疫分析法测定血清前列腺特异性抗原的研究　１２７　定２０次，计算　，ｓ．分析灵敏度是指能与“０”值校准　列腺癌方面是最有应用价值的标志物　．对中老年　Ｏ　Ｏ　＆　Ｏ　Ｏ　品相区别的最低分析物浓度　Ｊ，本方法取９５．２％分　男性的资料进行分析，发现年龄、生活习惯与血清　布可能性的限值，以　±ｓ对应的胰岛素的浓度作　ＰＳＡ的含量也存在一定的关系，年龄对血清ＰＳＡ含　１　４　８　５　９　Ｏ　１　３　为分析的灵敏度．检测结果：　为０．０１　ｇ／Ｌ，ｓ为　量的影响是前列腺癌发病的重要因素之一，中老年　８　５　６　８　土　±　±　±　０．０００　５　ｇ／Ｌ．本方法的灵敏度（变异系数ＣＶ）为　男性血清ＰＳＡ含量随年龄的增长逐渐升高，因激素　Ｏ　Ｏ　Ｏ　Ｏ　１　２　Ｏ　２　Ｏ　１　４　１　６　７　３　Ｏ　５％，符合临床常规分析法的要求（ＣＶ≤５％）．　平衡失调，前列腺结缔组织增生而引起前列腺肥　２．２线性　大、血清ＰＳＡ的含量升高，这提示随着年龄的增长，５　４　５　４　１　９　Ｏ　７　　用样品稀释液对高浓度的前列腺特异性抗原　前列腺疾病的发病率也在升高．当发生前列腺癌　５　６　４　５　标准品进行不同比例的稀释（５０％，２５％，１２．５％，　时，前列腺的正常腺管结构遭到破坏，血清中ＰＳＡ　２　３　７　５　Ｏ　９　７　６　１０％，５％），根据稀释的比例计算出各浓度样品的　含量急剧升高．　３　７　９　７　＋一　土　＋一　＋一　预期值，样品按照随机次序进行检测，每个浓度重　发光免疫分析目前在临床中应用已超过４０　Ｏ　Ｏ　Ｏ　Ｏ　１　１　３　７　６　Ｏ　８　９　６　３　９６　　复测定１０次，将各浓度测定值的　与预期值进行　项，主要集中在甲状腺、生殖系统、贫血、肿瘤标记　比较，在０．５～８０　ｇ／Ｌ的范围内线性良好．　物、心血管疾病、治疗药物的检测等，并有其快速、５　４　４　５　２　７　６　Ｏ　　２．３精密度　２　８　６　８　准确、灵敏度高等特点而被临床广泛接受，但诊断　用样品稀释液系列稀释前列腺特异性抗原标　试剂依赖进口、价格昂贵．本课题的研究意义在于　准品，配制４种浓度的检测样品，浓度分别为１．０，　建立我国自己的实验方法，降低医疗成本，降低放　２。０，４．０，８．０　ｇ／Ｌ，分装后一４℃保存，每种浓度的　射同位素对环境及实验人员的损害，保护环境．　样品分别连续测定１０次，计算各浓度的批内　，ｓ和　化学发光酶免疫分析法的灵敏度高、线性范围　ＣＶ；每个浓度每天测定１次，连续测定２０　ｄ，计算各　宽、设备简便，是一种应用极其广泛的现代医学检　浓度的批内元，ｓ和ＣＶ．见表２．　测技术．该方法集免疫分析特异性强与化学发光灵　表２批内与日间变异系数　Ｔａｂ．２　Ｗｉｔｈｉｎ－ｒｕｎ　ａｎｄ　ｂｅｔｗｅｅｎ—ｄａｙ　ｃｏｅｆｉｆｃｉｅｎｔｓ　ｏｆ　敏度高于一身，以ＨＲＰ．鲁米诺一Ｈ　Ｏ　发光底物液作　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　为发光体系，建立非放：射性化学发光免疫分析法，　用于测定血清前列腺特异性抗原取得满意结果．它　不仅分析成本低，最重要的是无放射性污染，是当　前能与ＲＩＡ媲美的非放射免疫测定方法之一，可望　在临床医学中得到广泛应用．　参考文献：　２．４干扰实验　在前列腺特异性抗原浓度为２．３　ｇ／Ｌ的新鲜　『１］Ｄ　Ｒｏｂｅｒｔ　Ｄｕｆｏｕｒ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｄａｔａ『Ｍ１．　Ｗｌａ￣ｊｉｎｇ：Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，　混合血清样品中分别加入高浓度的血红蛋白　１９９９：１０．　（ｒｉｂ）、总胆红素（ＴＢｉｌ）、甘油三酯（ＴＧ），获得干扰　［２］ＴｈｅＩｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆＩｍｒａｕｎｏｒｅａｅｔｎａｔｓ　ｏｎ　Ｓｏｌｉｄｌ￣ｌｓｅｓ［ｃ］∥　样品，用同样的方法加入样品稀释液作为对照样品，　Ｔｉｊｓ￣ｎ　Ｐ．Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ．　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：Ａｍｅｓｔｅｒｄａｍ，１９，ｇ５：２９７－３２８．　每个样品按照随机次序测定１０次，取干扰样品和对　［３］Ｈｅｎ￣ｌａＩＡ．ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＨｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎＩＨ瑚】ｍａｓｓａｙ［Ｍ］．　照样品各自测定值的　计算干扰率。在血红蛋白浓　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ　Ｗｅｔｌｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ。１９９１：２６－３３．　［４］Ａｌｌａｕｚｅｎ　Ｓ，Ｊｇｙ　Ｓ，Ｇｒ￣ｅ！‘Ｃ，ｅｔ　ａｆ．￣ｙｓｉｓ　ｏｆ３　Ｈｕｒｒａｈ　度＜２．４　ｇ／Ｌ、总胆红素浓度＜３４２￣ｒｎｏｌ／Ｌ、甘油三酯　Ｉｎｓｕｌｉｎ　Ｒｅｖｅａｌｓ　Ａｎｔｌｇｅｎｌｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｏｍｅ　Ｅｖｏｌｕｔｋｍａｒｉｌｙ　Ｃｏｍｅｘｖｅｄ　浓度＜９．９　ｍｍｏｌ／Ｌ时的干扰率无临床意义　Ｊ。　Ｒｅａｉｄｕｅｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｍａｌａｒ￣ｍｍｏｌｏｇｙ，１９９５，３２：２７－３６．　２．５方法学比较　［５］冯仁丰．分析灵敏度（检测线）［Ｊ］．上海医学检验杂志，　收集新鲜临床血清样品４０份（前列腺特异性　２ｏｏ２，１７（３）：１３３—１３６．　［６］Ｚａｎｉｎｏｔｔｏ　Ｍ，Ｐａｇａｎｉ　Ｆ，Ａｈ／ｎｉｅｒ　Ｓ，ｅｔ　ａｆ．Ｍｕｌｔｉｅｅｎｔｅｒ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　抗原浓度范围１。０～１５　ｇ／Ｌ），以ＲＩＡ（ｘ）作为比　ｏｆ　Ｆｉｖｅ　ｆｏｒ　Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ　Ｄｅｔｅｎ，ｄｎａ６ｏｎ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　ｔｈｅｍ，２００Ｏ，　较方法，以本实验建立的ＣＬＥＩＡ（Ｙ）同时进行检　４５：１６．３１—１５．３７．．　［７］韩景辉．血清ＰＳＡ测定诊断前列腺癌的临床意义［Ｊ］．　测，对检测结果进行配对ｔ检验，二者无显著性差异　中国热带医学，２００５，５（５）：１０５０．　（ｔ＝０．２９５，Ｐ＝０．８２）．　【责任编辑：王坤】　３　讨　论　血清前列腺特异性抗原（ＰＳＡ）在早期诊断前