一种透明质酸-己二酸二酰肼-百里醌接枝物、合成方法及其应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103833871 A(43)申请公布日 2014.06.04

(21)申请号 201410098871.1(22)申请日 2014.03.18

(71)申请人中国药科大学

地址211198 江苏省南京市江宁区龙眠大道

639号(72)发明人周建平 朱玛 郑立发(51)Int.Cl.

C08B 37/08(2006.01)A61K 47/48(2006.01)A61K 31/122(2006.01)A61P 35/00(2006.01)

权利要求书2页 说明书5页 附图6页权利要求书2页 说明书5页 附图6页

()发明名称

一种透明质酸-己二酸二酰肼-百里醌接枝物、合成方法及其应用(57)摘要

本发明提供了一种透明质酸-己二酸二酰肼-百里醌接枝物、合成方法及其应用，属于药物制剂领域。首先合成透明质酸-己二酸二酰肼，然后将百里醌接上去，最后形成透明质酸-己二酸二酰肼-百里醌接枝物。与现有技术相比，本发明以己二酸二酰肼为连接桥，将百里醌连接在透明质酸上，所得接枝物具有pH敏感性释放特性，能够显著提高百里醌肿瘤靶向性。

CN 103833871 ACN 103833871 A

权 利 要 求 书

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1.一种透明质酸-己二酸二酰肼-百里醌接枝物，其特征在于，其结构如下：

n＝10-30。

2.权利要求1所述透明质酸-己二酸二酰肼-百里醌接枝物的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)透明质酸-己二酸二酰肼接枝物的合成：①反应：以重量份计，取透明质酸100-300份，加入到浓度为(0.05-0.15)mol/L的己二酸二酰肼水溶液中，用盐酸调节pH至4.75，然后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，反应1-3h，期间每隔5-10min用盐酸调节pH使其维持在4.75；

②终止：上述反应时间结束时，用氢氧化钠调节其pH至7.0，终止反应，得反应液A；③透析过滤：将上述反应液A放入透析袋中，依次用0.1mol/L的氯化钠溶液、乙醇-水体积比为25∶75的乙醇水溶液和双蒸水透析，完成后微孔滤膜过滤，冷冻干燥，得冻干粉，4℃保存备用；

(2)透明质酸-己二酸二酰肼-百里醌接枝物的合成：①反应：取一定量上述冻干粉和过量百里醌，分别用双蒸水和乙醇溶解，所述水和乙醇的体积比为60∶40，然后混合，60℃避光反应3-8h，得反应液B；②纯化：将上述反应液B放入透析袋中，用乙醇透析，完成后离心，取出下层沉淀用乙醇洗涤，干燥，即得。

3.根据权利要求2所述透明质酸-己二酸二酰肼-百里醌接枝物的合成方法，其特征在于，所述透明质酸的分子量为2000-8000。

4.根据权利要求2所述透明质酸-己二酸二酰肼-百里醌接枝物的合成方法，其特征在于，所述透析袋的分子量为1000-3500，透析时间为1-2天。

5.根据权利要求2所述透明质酸-己二酸二酰肼-百里醌接枝物的合成方法，其特征在于，所述步骤(2)中的离心条件为(1000-10000)r/min，离心时间为5-10min。

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权 利 要 求 书

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6.权利要求1所述透明质酸-己二酸二酰肼-百里醌接枝物在制备抗肿瘤制剂中的应用，其特征在于，所述透明质酸-己二酸二酰肼-百里醌接枝物在制备抗肿瘤注射制剂或者口服制剂中的应用。

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说 明 书

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一种透明质酸-己二酸二酰肼-百里醌接枝物、合成方法及

其应用

技术领域

本发明涉及一种透明质酸-己二酸二酰肼-百里醌接枝物及其合成方法，属于药

物制剂领域。

[0001]

背景技术

百里醌(thymoquinone，TQ)是近年来从黑种草籽油中分离出来的主要有效单体，

研究发现其具有潜在的防癌和抑癌效应，可抑制结肠癌、乳腺癌、胰腺癌和肺癌等多种肿瘤细胞生长，并诱导细胞凋亡；百里醌还能抑制前列腺癌等多种恶性肿瘤转移。但是百里醌水溶性极差，制成一般的制剂，体内生物利用度太低，无法满足抗肿瘤的要求。因此，开发新的载体来提高其生物利用度值得深入研究。[0003] 细胞表面受体多样，选择合适的受体及其配体是实现药物主动勒向的关键，CD44是研究比较广泛的细胞表面受体，在肿瘤的发生、发展方面具有重要的作用。CD44是一种细胞表面广泛表达的跨膜糖蛋白，可以与细胞外基质或其配体结合，参与细胞粘附，信息传导等生理功能的调节。采用透明质酸(HA)可以作为靶向因子靶向高度表达CD44的肿瘤部位，达到药物肿瘤主动靶向的目的。目前HA作为肿瘤祀向因子的研究广泛，而且抗癌疗效显著，是理想的靶向因子选择。

[0004] 透明质酸(HA)是一种由N-乙酰-D-葡萄糖胺和D-葡萄糖酸酸经P-1，4糖苷键连接而成的线性高分子氨基葡聚糖。透明质酸为水溶性材料，具有一定的粘度和保水性。且HA具有很多优势：水溶性好，生物可降解，生物相容性好，无毒，无免疫原性，容易进行化学修饰等。

[0002]

发明内容

[0005] 本发明的目的在于，提供一种透明质酸(HA)-己二酸二酰肼(ADH)-百里醌(TQ)接枝物及其合成方法，这种接枝物能够提高百里醌的溶解度和生物利用度，并且能够使百里醌实现肿瘤主动靶向性。

[0006] 本发明是采用下述方案实现的：

[0007] 本发明提供了一种透明质酸-己二酸二酰肼-百里醌接枝物，其结构如下：

[0008]

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说 明 书

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n＝10-30。

[0010] 本发明还提供了上述透明质酸-己二酸二酰肼-百里醌接枝物的合成方法，包括如下步骤：

[0011] (1)透明质酸-己二酸二酰肼(HA-ADH)接枝物的合成：[0012] ①反应：以重量份计，取透明质酸100-300份，加入到浓度为(0.05-0.15)mol/L的己二酸二酰肼水溶液中，用盐酸调节pH至4.75，然后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，反应1-3h，期间每隔5-10min用盐酸调节pH使其维持在4.75；[0013] ②终止：上述反应时间结束时，用氢氧化钠调节其pH至7.0，终止反应，得反应液A；

[0014] ③透析过滤：将上述反应液A放入透析袋中，依次用0.1mol/L的氯化钠溶液、乙醇-水体积比为25∶75的乙醇水溶液和双蒸水透析，完成后微孔滤膜过滤，冷冻干燥，得冻干粉，4℃保存备用；

[0015] (2)透明质酸-己二酸二酰肼-百里醌(HA-ADH-TQ)接枝物的合成：[0016] ①反应：取一定量上述冻干粉和过量百里醌，分别用双蒸水和乙醇溶解，所述水和乙醇的体积比为60∶40，然后混合，60℃避光反应3-8h，得反应液B；[0017] ②纯化：将上述反应液B放入透析袋中，用乙醇透析，完成后离心，取出下层沉淀用乙醇洗涤，干燥，即得。[0018] 作为优选，所述透明质酸的分子量为2000-8000。[0019] 作为另一种优选，所述透析袋的分子量为1000-3500，透析时间为1-2天。[0020] 作为另一种优选，所述步骤(2)中的离心条件为(1000-10000)r/min，离心时间为5-10min。

[0021] 最后，本发明还提供了所述透明质酸-己二酸二酰肼-百里醌接枝物在制备抗肿瘤注射制剂或者口服制剂中的应用。

[0009]

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说 明 书

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如说明书附图1所示，本发明以己二酸二酰肼为连接桥，将百里醌连接在透明质

酸上，所得接枝物具有pH敏感性释放特性，能够显著提高百里醌肿瘤靶向性。附图说明

[0023] [0024] [0025] [0026] [0027] [0028]

图1为透明质酸-己二酸二酰肼-百里醌接枝物的合成流程图；图2为TQ、HA、HA-ADH和HA-ADH-TQ的紫外吸收图谱；

图3为HA、ADH、TQ、HA-ADH和HA-ADH-TQ的质谱图；图4为TQ的红外图谱；图5为HA-ADH的红外图谱；图6为HA-ADH-TQ的红外图谱；

具体实施方式[0029] 实施例1

[0030] (1)透明质酸-己二酸二酰肼接枝物的合成：[0031] ①反应：取透明质酸100mg，分子量为2000，加入到浓度为0.05mol/L的己二酸二酰肼水溶液中，用盐酸调节pH至4.75，然后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，反应1h，期间每隔5min用盐酸调节pH使其维持在4.75；[0032] ②终止：上述反应时间结束时，用氢氧化钠调节其pH至7.0，终止反应，得反应液A；

[0033] ③透析过滤：将上述反应液A放入分子量为1000的透析袋中，依次用0.1mol/L的氯化钠溶液、乙醇-水体积比为25∶75的乙醇水溶液和双蒸水透析，透析时间为1天，完成后微孔滤膜过滤，冷冻干燥，得冻干粉，4℃保存备用；

[0034] (2)透明质酸-己二酸二酰肼-百里醌接枝物的合成：[0035] ①反应：取一定量上述冻干粉和过量百里醌，分别用双蒸水和乙醇溶解，所述水和乙醇的体积比为60∶40，然后混合，60℃避光反应3h，得反应液B；[0036] ②纯化：将上述反应液B放入透析袋中，用乙醇透析，完成后1000r/min离心10min，取出下层沉淀用乙醇洗涤，干燥，即得。[0037] 实施例2

[0038] (1)透明质酸-己二酸二酰肼接枝物的合成：

①反应：取透明质酸300mg，分子量为5000，加入到浓度为0.15mol/L的己二酸二

酰肼水溶液中，用盐酸调节pH至4.75，然后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，反应3h，期间每隔10min用盐酸调节pH使其维持在4.75；[0040] ②终止：上述反应时间结束时，用氢氧化钠调节其pH至7.0，终止反应，得反应液A；

[0041] ③透析过滤：将上述反应液A放入分子量为3500的透析袋中，依次用0.1mol/L的氯化钠溶液、乙醇-水体积比为25∶75的乙醇水溶液和双蒸水透析，透析时间为2天，完成后微孔滤膜过滤，冷冻干燥，得冻干粉，4℃保存备用；

[0042] (2)透明质酸-己二酸二酰肼-百里醌接枝物的合成：[0043] ①反应：取一定量上述冻干粉和过量百里醌，分别用双蒸水和乙醇溶解，所述水和

[0039]

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说 明 书

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乙醇的体积比为60∶40，然后混合，60℃避光反应8h，得反应液B；[0044] ②纯化：将上述反应液B放入透析袋中，用乙醇透析，完成后10000r/min离心5min，取出下层沉淀用乙醇洗涤，干燥，即得。[0045] 实施例3

[0046] (1)透明质酸-己二酸二酰肼接枝物的合成：[0047] ①反应：取透明质酸200mg，分子量为3000，加入到浓度为0.1mol/L的己二酸二酰肼水溶液中，用盐酸调节pH至4.75，然后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，反应2h，期间每隔5min用盐酸调节pH使其维持在4.75；[0048] ②终止：上述反应时间结束时，用氢氧化钠调节其pH至7.0，终止反应，得反应液A；

[0049] ③透析过滤：将上述反应液A放入分子量为3500的透析袋中，依次用0.1mol/L的氯化钠溶液、乙醇-水体积比为25∶75的乙醇水溶液和双蒸水透析，透析时间为2天，完成后微孔滤膜过滤，冷冻干燥，得冻干粉，4℃保存备用；

[0050] (2)透明质酸-己二酸二酰肼-百里醌接枝物的合成：[0051] ①反应：取一定量上述冻干粉和过量百里醌，分别用双蒸水和乙醇溶解，所述水和乙醇的体积比为60∶40，然后混合，60℃避光反应5h，得反应液B；[0052] ②纯化：将上述反应液B放入透析袋中，用乙醇透析，完成后50000r/min离心5min，取出下层沉淀用乙醇洗涤，干燥，即得。

[0053] 实施例4透明质酸-己二酸二酰肼-百里醌接枝物的表征[00] 将实施例3所制得的接枝物进行紫外分光光度法分析、质谱和红外光谱验证。[0055] 紫外分光光度法分析所得结果，如说明书附图2所示，HA和HA-ADH在200-500nm均没有最大吸收，TQ在260nm左右有最大吸收，而合成形成的HA-ADH-TQ最大吸收峰位置改变，在350nm左右有最大吸收。[0056] 质谱分析结果，如说明书附图3所示，HA的特征峰在2.01ppm和3.28-4.75ppm，而己二酸二酰肼和TQ的特征峰分别位于(1.63-1.79，2.19-2.45ppm)和(1.1，2.0，3.0和6.5ppm)。由HA-ADH和HA-ADH-TQ质谱图对比可得，HA-ADH-TQ质谱图在1.1，3.0和6.5ppm处多出三个特征峰，即为TQ的特征峰，证明TQ被成功的接入到HA-ADH上。[0057] 红外光谱分析结果，如说明书附图4、5和6所示，NH和OH键的伸缩振动峰在3500-3100cm-1范围内，相对应着HA-ADH中的腙键和羟基。在1700-1500cm-1范围内有三个特征峰，对应着C＝O键(15cm-1)、C＝C键(1617cm-1)、和C＝N键(1552cm-1)，C＝N键证明了腙键的形成。此外，与TQ质谱图相比较，接枝物中C＝O键密度降低，也证明了腙键的形成。

[0058] 实施例5透明质酸-己二酸二酰肼-百里醌接枝物中百里醌的体外释放[0059] 释放介质分别为pH＝5和6的乙酸缓冲液、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液。分别精确称量2mg HA-ADH-TQ(其中TQ232ug)接枝物溶解在于释放介质相对应的媒介中，并转移到透析袋(MWCO2000DA)，放入玻璃容器中完全浸没在释放介质中，密封，避光，在37℃的水浴下震荡。以固定的时间间隔，将样品取出并用相同体积的新鲜释放介质替换。药物释放测量用HPLC。所有实验平行做三份。

[0060] 百里醌是通过对酸敏感的腙键偶联到HA，所以药物是pH依赖性释放，使用三种不

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说 明 书

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同pH的释放介质(5，6，7.4)，如说明书附图7所示，在最初的24小时内百里醌的释放量分别大约是56％，36％和17％，4天后的释放量大约是74％(pH5)和60％(pH6)但是pH7.4的只有35％。当酸敏感键断裂后，百里醌先要从接枝物所形成的聚集体中释放，然后再扩散出去。百里醌在生理pH7.4下相对较少的释放，将有助于减少药物在体循环中的损失，从而确保所载药物在pH较低的肿瘤附近释放。[0061] 实施例6活体成像实验

[0062] 小鼠淋巴瘤细胞(EL4)在含有10％胎牛血清的RPMI10培养48小时(80％铺满)，要求在37℃含5％CO2的潮湿环境中。取上述小鼠淋巴瘤细胞约(1-1.5*10^6)个，皮下接种于C57/BL6小鼠的腋下区域(8周龄，20-25g重)。使用FITC作为荧光探针偶联到HA-ADH-TQ接枝物形成HA-ADH-TQ-FITC接枝物。接种肿瘤后10天，将HA-ADH-TQ-FITC接枝物溶解在pH7.4的PBS中，以20mg/kg的剂量注射到荷瘤小鼠的尾静脉中，研究它们在动物体内的生物分布和肿瘤靶向功效。离体成像实验是用注射2-8小时后的动物，处死取器官，用体内成像系统(Carestream Health inc美国)拍照，用(Carestreame分子成像软件)进行图像分析。

[0063] 结果如说明书附图8所示，显示出接枝物在注射2小时后非常快速和有选择的在肿瘤组织聚集，8小时后进一步聚集，这主要归因于淋巴瘤细胞中的CD44受体的过度表达而主动摄取。需要注意到，在肺和肾脏有微弱的荧光信号，也是因为HA受体在这些组织中有存在。然而相比于肿瘤中是极少的。对于心脏，肝脏和脾脏没有检测到显著的荧光信号，这也进一步说明了，接枝物能够避免被肝脏摄取，从而能够更长时间的循环。

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说 明 书 附 图

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图1

图2

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说 明 书 附 图

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图3

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说 明 书 附 图

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图4

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说 明 书 附 图

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图5

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说 明 书 附 图

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图6

图7

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说 明 书 附 图

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图8

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